新型鼻腔填塞材料聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶的细胞相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.012

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (10): 1546-1551.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.012

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新型鼻腔填塞材料聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶的细胞相容性

杨国慧，韩德民，臧洪瑞，李立峰

首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)，北京市　100730

收稿日期:2017-02-12 出版日期:2017-04-08 发布日期:2017-05-08
通讯作者: 韩德民，教授，中国工程院院士，博士生导师，首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，耳鼻咽喉头颈科学教育部重点实验室(首都医科大学)，北京市 100730
作者简介:杨国慧，女，山西省朔州市人，首都医科大学在读硕士，主要从事鼻科基础与临床，上气道通气功能障碍疾病的研究。
基金资助:
北京市医院管理局“使命”人才计划项目(SML20150201)

Cytocompatibility of a novel nasal packing material made of polyethylene glycol diacrylate composite hydrogel

Yang Guo-hui, Han De-min, Zang Hong-rui, Li Li-feng

Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Capital Medical University, Ministry of Education, Beijing 100730, China

Received:2017-02-12 Online:2017-04-08 Published:2017-05-08
Contact: Han De-min, Academician, Doctoral supervisor, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Capital Medical University, Ministry of Education, Beijing 100730, China
About author:Yang Guo-hui, Studying for master’s degree, Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Key Laboratory of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Capital Medical University, Ministry of Education, Beijing 100730, China
Supported by:
the Talent Plan Project of Beijing Municipal Administration of Hospitals, No. SML20150201

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶：是由聚乙二醇双丙烯酸酯、羧甲基壳聚糖和聚乙烯醇三者水溶液经光交联形成，具有良好的吸水性能、高膨胀性能，柔软性好，具有良好的生物相容性和生物降解性。
鼻腔填塞材料：按是否可吸收，可分为可吸收型和非吸收型；可吸收型可分为易于吸收的止血绫、止血纱布、速即纱，不易吸收的藻酸钙、明胶海绵、止血纤维；非吸收型分为不可降解的膨胀海绵、硅胶管、油纱条，可降解的纳吸棉等。

背景：前期研究发现聚乙二醇双丙烯酸酯和壳聚糖形成的复合物可生物降解吸收，具有抗炎消肿能促进创面愈合作用，且生物相容性好，然而该复合物质地较脆，鉴于鼻腔解剖结构，需要一种具有力学支撑性能的材料来克服这种缺陷。
目的：观察新型可降解吸收鼻腔填塞材料聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶的细胞相容性。
方法：通过光交联将聚乙二醇双丙烯酸酯、壳聚糖、聚乙烯醇材料复合，形成聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶，根据国际通行医疗器械生物学评价标准采用直接解触法及间接浸提法评价其细胞相容性。①直接解触法：将聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶与小鼠成纤维细胞L929共培养24 h，观察形态变化；②间接浸提法：分别以100，50 μL聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶浸提液及100 μL RPMI1640培养液培养小鼠成纤维细胞L929，CCK-8法检测培养1-3 d的增殖及细胞毒性。
结果与结论：①直接解触法：材料周围细胞形态呈伴突起的梭形或星形的扁平状结构，贴壁性生长，细胞饱满且折光性强，整体呈生长趋势，可见该材料生物相容性良好；②间接浸提法：随着时间的增加，含复合物水凝胶浸提液组细胞数量增加，细胞相对增殖率逐渐增加，细胞毒性为0至1 级；③结果表明：聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶材料具有良好的细胞相容性。

ORCID: 0000-0002-5902-5718(韩德民)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶, 鼻填塞材料, 细胞毒性, 小鼠成纤维细胞

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that the complex of polyethylene glycol diacrylate and chitosan is biodegradable, has the anti-inflammation effect and can promote wound healing, with good biocompatibility. However, the composite material is brittle, and thus, it is necessary to develop a mechanical support material due to the anatomy of the nasal cavity.
OBJECTIVE: To study the cytocompatibility of a novel degradable absorbable nasal packing material made of polyethylene glycol diacrylate composite hydrogel.
METHODS: In our experiment, the composite hydrogel was formed by the combination of different ratios of polyethyleneglycol diacrylate, chitosan and polyvinyl alcohol using photo-crosslinking method. According to the international standard of medical devices, we used direct and indirect international standard experimental methods to evaluate the cytotoxicity of the materials. (1) Direct contact method: the polyethylene glycol acrylate composite hydrogel and mouse fibroblasts L929 were co-cultured for 24 hours to observe the morphological changes of cells. (2) Indirect extraction: mouse fibroblasts L929 were cultured in polyethylene glycol diacrylate composite hydrogel extracts (100, 50 μL) and RPMI1640 medium (100 μL), respectively, for 3 days to observe the proliferation and cytotoxicity by cell counting kit-8 assay.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Direct contact method: the cells around the material formed a flat structure with fusiform or stellated protrudes. The material was confirmed to have good biocompatibility depending upon the presence of adherent cell growth, full and strong refraction, and the overall growth trend. (2) Indirect extraction method: with the increase of time, the number of cells in the hydrogel extract group increased, the relative proliferation rate of cells increased gradually, and the cytotoxicity was 0 to 1. To conclude, these experimental findings indicate that the polyethylene glycol acrylate composite hydrogel material has good cytocompatibility.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Polyethylene Glycols, Chitosan, Hydrogel

中图分类号:

R318

杨国慧，韩德民，臧洪瑞，李立峰. 新型鼻腔填塞材料聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶的细胞相容性[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1546-1551.

Yang Guo-hui, Han De-min, Zang Hong-rui, Li Li-feng. Cytocompatibility of a novel nasal packing material made of polyethylene glycol diacrylate composite hydrogel[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1546-1551.

图/表（结果） 4

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引言

鼻内镜术后填塞是鼻内镜外科技术的重要组成部分，随着鼻内镜外科技术发展、手术机械的不断变革，各种新型材料出现，使得鼻腔填塞材料也有了不断更新，为临床治疗鼻出血和防止鼻腔鼻窦术后出血粘连或再狭窄提供了更多的选择^[1]。然而由于患者病情特异性、鼻腔解剖结构复杂性，鼻部血管丰富性，选择恰当的鼻腔填塞材料对术后鼻腔黏膜恢复、有效控制出血至关重要。好的填塞材料应易于填塞和取出，无毒，对人体及局部黏膜无刺激、损害和致敏，可促进创口愈合，抗感染，可维系鼻腔通气，患者痛苦小及经济等^[2]。目前可应用的鼻腔填塞材料很多，可吸收降解止血材料因止血效果快速，可降解吸收，无需取出，明显减轻了患者疼痛，提高了术后舒适度，避免二次出血，降低了术后并发症的风险而成为近年来填塞材料发展趋势^[3]。纳吸棉是目前临床应用广泛的可降解吸收止血材料，因其产地位于荷兰，属进口产品，价格昂贵，加重患者经济负担^[4]。因此拟研发出一种效能可替代纳吸棉材料且成本相对低廉的新可降解吸收型材料。

最近研究表明根据每一种生物材料的特性，采用物理或化学方法将具有不同生物特性的材料复合，以期消除各单一组分性能上的弱点，获得综合性能更为理想的聚合物材料服务于临床^[5]。前期研究显示聚乙二醇双丙烯酸酯和壳聚糖形成的复合物可生物降解吸收，具有抗炎消肿作用，能促进创面愈合且生物相容性好^[6]。然而该复合物质地较脆，鉴于鼻腔解剖结构，需要一种具有力学支撑性能的材料来克服这种缺陷。作为临床广泛使用的聚乙烯醇材料抗张强度较高，具有良好的力学性能，组织相容性好，已被广泛应用于临床^[7]。因此通过光交联使三者形成复合物水凝胶，是一种亲水的三维聚合物网络，实验证实其具有良好的吸水性能、高膨胀性能，柔软性好，具有良好的生物相容性和生物降解性^[8]。实验依据GB/T16886/ISO10993 国际标准第五部分关于体外细胞毒性实验要求原则进行细胞相容性评估^[9]，为该材料进行下一步试验提供依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照细胞学实验。

1.2 时间及地点实验于2016年7至12月在北京市耳鼻咽喉科研究所完成。

1.3 材料聚乙二醇二丙烯酸酯(北京华威锐科化工有限公司)；氨水(国药集团化学试剂有限公司)；羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇(北京华威锐科化工有限公司)；小鼠成纤维细胞系L929(里苏(上海)生物技术有限公司)；RPMI16409 (Corning Cellgro 10-010-CV)；胰酶(Corning 25-053-CI)胎牛血清(hyclone)；Cell Counting Kit-8(日本同仁CK04)；PBS(Corning 21-040-CV)；96孔培养板(Corning 353072)；细胞培养瓶(Corning 430168)；CO₂培养箱（thermo BB15uv)；倒置相差显微镜(Nikon Ti)；酶联免疫检测仪(Molecular Devices SPECTRAmax PLUS)；超净工作台(苏州净化)；高速离心机，微量移液器(eppendorf)；热空气消毒箱(Heraeus SUT6120)。

1.4 实验方法

1.4.1 材料的制备^[10-11] 配制一定浓度的聚乙二醇二丙烯酸酯水溶液，加入氨水，超声5 min后，加入羧甲基壳聚糖水溶液和聚乙烯醇水溶液，进一步搅拌超声10 min，混合均匀后，放在紫外光灯下照射，控制照射时间为25 min，洗涤制备的聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶，放入离子水中静置2-4 h，每1 h换1次水，随后冷冻干燥，获得产物。

1.4.2 实验用材料浸提液的制备将材料切成长1.0 cm的正方体，按每1 cm²表面积的正方体材料块加入15 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液浸泡，于37 ℃条件下在CO₂培养箱内培养24 h，制成浸提液备用。

1.4.3 直接接触法细胞实验^[12] 将小鼠成纤维细胞悬浮液接种于培养皿中。①制备细胞悬浮液：将培养瓶中的L929小鼠成纤维细胞用0.25%胰酶消化，加5 mL培养基，移入离心管，1 000 r/min离心5 min，进行细胞计数，制成细胞浓度为1×10⁸ L^-1的细胞悬浮液；②接种于培养皿：取6个60 mm培养皿，在每个培养皿中加入4 mL细胞悬浮液，孵育2 d直至其融合成近似细胞单层；③接触法毒性实验方法及毒性评级标准：每日于倒置相差显微镜下观察L929细胞生长情况，将6个培养皿分成2组，每组3个培养皿，对照组为细胞单独培养；实验组将材料切成长0.5 cm、宽 0.3 cm、厚0.3 cm的长方体块，置入含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液中浸泡，使其充分膨胀，取出，放于培养皿，使其与细胞单层直接接触，继续培养24 h后观察细胞形态变化并照相，实验重复6次。

1.4.4 CCK-8细胞增殖法细胞毒性实验^[13] 将培养的L929细胞用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液稀释消化，配成细胞浓度1×10⁶ L^-1的单细胞悬液；取3块96孔培养板，在每板分别做好标记1，2，3 d。每板选中间5×8共40孔作为实验用孔，每孔接种100 μL的细胞悬浮液，每板接种30孔，另外10孔空白组不加细胞，置含体积分数5%CO₂培养箱中37 ℃培养2 h；待细胞贴壁，分3组培养，两实验组分别加入100，50 μL聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶浸提液，对照组加入100 μL RPMI1640培养液，每组10复孔；空白组加入200 μL RPMI1640培养液；将3块培养板置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱，按所做标记于接种后1，2，3 d取出培养板，每板40孔中加入CCK-8 10 μL，继续在37 ℃条件下培养3 h。选择450 nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(A)，并计算细胞相对增殖率RGR(%)=(实验组A均值-空白组A均值)/(对照组A均值-空白组A均值)×100%。

根据各组细胞吸光度值和相对增殖率(RGR)，即可画出该组作用下的L929 细胞生长和增殖曲线。当细胞相对增殖率为≥100%时，细胞毒性0级；当细胞相对增殖率在75%-99%之间，细胞毒性1级；当细胞相对增殖率在50%-74%之间，细胞毒性2级；当细胞相对增殖率在25%-49%之间，细胞毒性3级；当细胞相对增殖率在1%-24%之间，细胞毒性4级；细胞相对增殖率为0，细胞毒性5级。

1.5 主要观察指标小鼠成纤维细胞L929与聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶共培养后的形态、增殖情况。

1.6 统计学分析光吸收值和细胞相对增殖率均采用x(_)±s表示，采用SPSS 22.0 统计软件对各时间点各组数据进行单因素方差分析，组间两两比较采用Student-Newman- Keuls( SNK)法，设定α=0.05。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

鼻腔填塞是防预鼻腔鼻窦术后出血，对鼻腔起支撑塑形、预防粘连或再狭窄，以及临床治疗鼻出血进行填塞止血的重要措施。目前可应用的鼻腔填塞材料很多，按是否可吸收，可分为可吸收型和非吸收型；可吸收型可分为易于吸收的止血绫、止血纱布、速即纱，不易吸收的藻酸钙、明胶海绵、止血纤维；非吸收型分为不可降解的膨胀海绵、硅胶管、油纱条，可降解的纳吸棉等^[14]。初晓夏等^[13]比较临床常用止血材料海藻酸钙、明胶海绵、纳吸棉、普通纱布等的细胞毒性，结果显示在浸提液法当中，不同浓度梯度海藻纤维止血敷料、纱布、纳吸棉浸提液的细胞毒性均为1 级，100%、75%明胶止血海绵浸提液的细胞毒性为3 级；在直接接触法中，纱布与海藻纤维止血敷料的细胞毒性1 级，纳吸棉为2 级，明胶止血海绵的细胞毒性为3 级。

作为临床广泛使用的纳吸棉具有高膨胀压迫止血作用且效果快速，同时可生物降解吸收，提高患者舒适度，术后无须取出，无需忍受二次疼痛及避免术腔再次出血可能^[15]。Verim等^[16]在对56例慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者术后进行膨胀海绵及纳吸棉双鼻孔填塞的对照研究中发现，两者在术后术腔黏膜的恢复过中，水肿、结痂、粘连、分泌物、肉芽、上皮化形成及手术治疗效果方面无显著差异，然而纳吸棉在术后鼻堵、鼻出血、疼痛、颜面水肿等主观症状方面明显优于膨胀海绵。Moon等^[17]对109例鼻骨骨折患者分别填塞纳吸棉与凡士林纱条的对照研究中发现，纳吸棉在减轻患者术后疼痛方面优于对照组，两者在止血、黏膜恢复、支撑塑性方面无明显差异，因此对于鼻骨骨折患者术后填塞物也可选择纳吸棉。因此理想的鼻腔填塞材料具有止血效果好、快速，机械力学性能好，降解速度适宜、可生物降解吸收，经济，对术腔恢复没有不良反应等优点^[18-19]。然而纳吸棉产于荷兰，价格昂贵，加重了患者经济负担。目前中国生物医药产业发展虽取得了一定成效，但生物医药产业对经济发展和社会进步的推动作用仍然不足，要开发出更多拥有自主知识产权的医药卫生科技成果，促进医疗健康服务业的发展^[20]。因此学者致力于研发一种可满足上述条件的质优价廉拥有自主知识产权的国产鼻腔填塞材料。

在临床上，鼻腔填塞材料与鼻腔黏膜接触时间为 2-15 d，可降解吸收材料因其生物降解性能可长达2周左右，因此临床应用前需对其进行生物材料相容性的评价，对术后术腔鼻黏膜恢复至关重要^[21]。评价材料生物相容性的方法，包括基因水平、细胞水平、组织水平等3个方面，而细胞毒性实验为最直观安全简便的评价方法，反映了材料与细胞间在分子水平的相互作用，其敏感性及特异性更高^[22]。国际标准对于细胞毒性评价方法有3种，浸提液法是使材料降解，观察其降解成分对细胞有无毒害性质；直接接触法为材料直接与细胞相接触的方法，直观下观察细胞形态变化。实验采用这两种方法更加全面且直观^[23]。区别传统的MTT法，浸提液法采用CCK-8比色法，CCK-8试剂中主要成分为水溶性四唑盐，是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下可被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜，生成的甲臜能够直接溶解在培养基中，活细胞的数目越多则颜色越深。用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量^[24]。与传统MTT相比，浸提液法具有下列优点：使用方便，检测快速，灵敏度高，对细胞毒性小，为1瓶溶液，无需配置。

聚乙二醇双丙烯酸酯水凝胶是由聚乙二醇双丙烯酸酯、羧甲基壳聚糖和聚乙烯醇3者水溶液经光交联形成，光交联为常见且广泛使用的构建水凝胶的方式，其反应条件温和，过程容易控制，反应效率高，副产物少，并且研究表明光聚合水凝胶已在许多生物医学领域方面显示了其特有的潜力^[25]。实验中选用聚乙二醇二丙烯酸酯和氨水为原料，以最近发现的双键和胺基之间的迈克尔加成反应为基础，利用光聚合和冷冻干燥技术，制备聚乙二醇基水凝胶海绵。采用羧甲基壳聚糖和聚乙烯醇对聚乙二醇基水凝胶进行共混改性，使其孔结构和力学性能得到提高，并通过红外，扫描电镜对其进行表征^[26]。

实验中从培养细胞的形态观察(定性)和CCK-8检测(定量)两方面评价细胞毒性。在直接接触法实验中，24 h后细胞数量多，偶有悬浮死细胞，说明材料对细胞形态无影响，细胞相容性良好。在浸提液法实验中，在1，2，3 d时间点检测不同浓度水凝胶材料浸体液的细胞毒性均为1级，符合生物材料的安全评价标准。对结果进行分析，培养1 d时，两材料浸提液组与对照组细胞相对增殖率比较差异有显著性意义(P < 0.05)；3 d时，两材料浸提液组与对照组细胞相对增殖率比较差异无显著性意义(P > 0.05)。分析产生这种结果的原因，从细胞培养方面分析，接种细胞24 h时，随着材料浸提液浓度增加，浓度不同会对细胞的生长有一定的影响，然而随着细胞培养天数增加，细胞密度增大，材料浓度的变化对细胞没有影响。因而可认为该材料对于形态良好、状态稳定、排列紧密的细胞无影响；从材料方面性质而言，据多篇文献报道，聚乙二醇二丙烯酸酯、羧甲基壳聚糖和聚乙烯醇这3种物质具有良好的生物相容性^[27-40]，然而对于其组成成分中的氨水在紫外线光照下若反应不完全，材料表面有残留，则浸提液中氨水呈碱性则会对细胞产生影响。因此要严格掌握紫外线照射下交联的时间及材料组成成分的浓度控制，保证其充分反应。张晓丹^[11]通过迈克尔加成反应合成了壳聚糖/聚乙二醇双丙烯酸酯衍生物，得出壳聚糖与聚乙二醇双丙烯酸酯复合物膜具有亲水性、吸水性、柔软贴合等良好的生物性能，而且具有良好的细胞相容性，有利于细胞的生长和增殖。

综上所述，由聚乙二醇双丙烯酸酯、壳聚糖、聚乙烯醇材料三者通过光交联形成的复合物水凝胶材料细胞相容性良好，符合生物体应用的要求，使得临床研发更加质优价廉的鼻腔填塞材料成为可能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

新型鼻腔填塞材料聚乙二醇双丙烯酸酯复合物水凝胶的细胞相容性

Cytocompatibility of a novel nasal packing material made of polyethylene glycol diacrylate composite hydrogel

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